EVALUACIÓN DE LAS INTERACCIONES ENTRE FACTORES PROTEICOS QUE PARTICIPAN EN LOS PROCESOS DE COAGULACIÓN SANGUÍNEA MEDIANTE LA IMPLEMENTACIÓN DE ENSAYOS DE RESONANCIA MAGNÉTICA NUCLEAR (RMN) DE PROTEÍNAS EN SOLUCIÓN.

Las enfermedades cardiovasculares, entre las que se encuentran los infartos cardíacos y los accidentes cerebrovasculares, continúan siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad en países desarrollados y en vías de desarrollo (Nichols, 2012).

Lo anterior se debe, en parte, a que las bases estructurales y funcionales de los procesos de formación de los coágulos sanguíneos o trombos se conocen sólo de forma incompleta y fragmentada. La trombina juega un papel esencial en estos procesos, y los fundamentos atómico-moleculares de su interacción con otros factores que participan en el proceso de coagulación son poco conocidos, en particular en el reconocimiento de importantes sustratos como el factor VIII y el receptor de plaquetas, PAR1. Dada la importancia de estos factores de coagulación, y siguiendo con la línea de investigación que se desarrolla actualmente en el proyecto 5401-1510-9201: “Expresión heteróloga, purificación, caracterización y cristalización de factores proteicos que participan en los procesos de coagulación sanguínea”; y en estrecha colaboración con grupos de investigación externos, se pretende caracterizar las interacciones del factor VIII con la trombina mediante RMN en estado líquido. Para ello, se implementará -por primera vez en Costa Rica- la poderosa técnica biofísica de RMN de proteínas para evaluar las interacciones entre estas dos importantes proteínas, el factor VIII y la trombina. Para cumplir esta meta, (1) se expresará de forma heteróloga los fragmentos conectores de los dominios del factor VIII (FVIIIa2 y FVIIIa3) en medio mínimo enriquecido con isótopos de carbono-13 y nitrógeno-15, (2) se purificarán y caracterizarán estos fragmentos recombinantes, y (3) se implementarán progresivamente los diferentes tipos de ensayos mono-, di- y tri-dimensionales de RMN para el análisis y evaluación de las interacciones de las proteínas de interés. Los avances obtenidos en estos estudios de RMN en estado líquido, complementarán los resultados que se están generando en el proyecto 5401-1510-9201 antes mencionado, los cuales en conjunto permitirán avanzar hacia una mejor comprensión de los procesos de interacción entre la trombina y estos factores; -y por lo tanto- de los mecanismos de formación de trombos.

Palabras claves: Enfermedad cardiovascular, RMN de proteínas, trombina, FVIII

• Subárea: Biotecnología de la Salud

A pesar de la relevancia médica y el impacto económico en los sistemas de salud de nuestra sociedad moderna, las enfermedades cardiovasculares, entre las que se encuentran los infartos cardíacos y los accidentes cerebrovasculares, continúan siendo la principal causa de morbilidad y mortalidad en países desarrollados y en vías de desarrollo (Nichols et al. 2012), y Costa Rica no se exime de esta situación. En parte, lo anterior se debe a que las bases estructurales y funcionales de los procesos de formación de los coágulos sanguíneos o trombos se conocen sólo de forma incompleta y fragmentaria. La trombina juega un papel esencial en estos procesos, y los fundamentos atómico-moleculares de su interacción con otros factores que participan en el proceso de coagulación son poco conocidas, en particular su reconocimiento de importantes sustratos como el cofactor VIII. Asimismo, el conocimiento de las bases moleculares de la interacción de fosfolipasas anticoagulantes presentes en el veneno de serpientes con los factores de la coagulación humana, como el FX, son poco estudiadas y son críticas para el mejor entendimiento de los procesos patofisiológicos de las mordeduras de serpientes, particularmente importante en regiones tropicales como la nuestra. Dada la importancia de estas proteínas que modifican los procesos de coagulación sanguínea, y continuando con el plan de ruta de esta línea de investigación, y con la colaboración del grupo de investigación del Dr. Pablo Fuentes-Prior (Instituto de Investigación Biomédica del Hospital de Sant Pau, Barcelona), del Dr. Julián Fernández, del Instituto Clodomiro Picado (UCR), y del master Javier Quesada de la Escuela de Química (UCR), se pretende caracterizar los mecanismos de interacción entre el FVIII y la trombina humana, junto con la fosfolipasa A2 anticoagulante presente en el veneno de serpiente costarricenses.

Esta investigación se entrelaza perfectamente, y es complementaria al plan de ruta de los dos proyectos que se desarrollan actualmente uno VIE (Centro Funcional: 1510030) y otro FEES (Centro Funcional: 1701148), los cuales en conjunto permitirán avanzar hacia una mejor comprensión de los procesos de interacción entre la trombina y estos factores proteicos; -y por lo tanto- de los mecanismos de formación de trombos y de los efectos patofisiológicos producto de mordeduras de serpientes.

PALABRAS CLAVE: Células madre de tejido adiposo, fracción vascular estromal, regeneración, células madre mesenquimales.

Los microorganismos son parte importante de nuestro ecosistema; algunos de ellos, como las bacterias, no solo se asocian a enfermedades (diarreas, infecciones, etc.), sino que también son beneficiosas para nuestro organismo (flora intestinal), e incluso algunas son utilizadas en procesos productivos industriales (yogurt, producción de insulina recombinante, etc.).

Debido a la relevancia médica y al importante impacto económico, las enfermedades son uno de los principales problemas a los que se destina una gran cantidad de recursos, es por ello que es fundamental disponer de métodos de detección e identificación, tanto de los patógenos humanos como de los antígenos de los mismos, con miras a la elaboración de tratamientos y vacunas más eficientes.

Por otra parte, los avances en la utilización de la espectroscopía Raman, tanto en el desarrollo tecnológico como en la comprensión de la técnica y las mejoras en la metodología, han permitido incursionar en campos como la Biología Celular y Molecular, lo que ha contribuido a definir las estructuras químicas de varios sistemas.

Por lo anterior, en este trabajo de investigación se pretende identificar y diferenciar las estructuras de tres tipos de bacterias mediante la utilización de la espectroscopía Raman, como un método rápido y complementario de otros análisis para permitir su identificación. Además, esto permitirá establecer la metodología necesaria para implementar el análisis de microorganismos en nuestro laboratorio.

Esta investigación aprovechará parte de la experiencia generada en el proyecto “Expresión heteróloga, purificación, caracterización y cristalización de factores proteicos que participan en los procesos de coagulación sanguínea” (Proyecto VIE: 5401-1510-9201) que actualmente se realiza en el Centro de Investigación en Biotecnología (TEC), así como la experiencia desarrollada en el Laboratorio de Espectroscopía Raman de la Escuela de Física, para la obtención de los espectros de RAMAN de algunas de las bacterias a estudiar.

PALABRAS CLAVE: Espectroscopía Raman, SERS, identificación, nanopartículas, bacterias, biomédica

• Subárea: Biotecnología de la Salud

A pesar de la relevancia médica, de la repercusión negativa en la calidad de vida y de la elevada inversión económica que se realiza en los sistemas de salud  de nuestra sociedad, existen algunas enfermedades que continúan siendo una carga importante para nuestra sociedad. Por ello es fundamental disponer de métodos de detección e identificación de moléculas de interés biomédico, nuevos o complementarios, con miras a la elaboración de protocolos más sencillos de detección para futuros tratamientos.
 
Entre las enfermedades con alta carga económica para los sistemas de salud se encuentran las enfermedades cardiovasculares, cuyas manifestaciones clínicas más evidentes son los infartos cardíacos y los accidentes cerebrovasculares, las cuales siguen siendo además la principal causa de morbilidad y mortalidad en países desarrollados y en países en vías de desarrollo, tales como Costa Rica (Nichols et al., 2012).

Aún la importancia médica de estas patologías, relacionadas en muchos casos con la formación de coágulos sanguíneos (o trombos), las bases moleculares de estos procesos no se conocen por completo. Sin embargo, una comprensión profunda de los mecanismos que conducen a la formación del coágulo de fibrina, desencadenado principalmente por la trombina, es fundamental para obtener un mejor entendimiento detallado de los eventos patofisiológicos asociados con la generación de este trombo. Esta información es también vital para interpretar las consecuencias de las mutaciones en el factor VIII, identificadas en pacientes con hemofilia A (mutaciones presentes en el gen F8) y avanzar hacia el tratamiento personalizado de las enfermedades cardiovasculares (Vencesla et al., 2008).
 
Dada la importancia de las proteínas trombina y factor VIII humanas en los procesos de coagulación sanguínea, es fundamental la evaluación e identificación de estas proteínas para posteriormente comprender mejor los mecanismos de interacción entre estas. Una de las técnicas utilizadas para la identificación de proteínas es la espectroscopía Raman. Desde hace algunos años, esta técnica ha sido utilizada en diversas áreas de investigación, tanto en la academia como en la industria (Lee y Meisel 1982, Lyon et al. 1998, Siddhanta y Narayana 2012, Han et al. 2010, Tian 2005); sin embargo, gracias al desarrollo tecnológico actual, la técnica ha evolucionado, lo cual ha permitido incursionar en diferentes campos, como lo es la caracterización de material de origen biológico (Fazio et al., 2016).

Palabras claves: Enfermedades cardiovasculares, trombina, FVIII, espectroscopia RAMAN, SERS, identificación de proteínas.

• Subárea: Biotecnología de la Salud

Algunos de los antibióticos que se utilizan en seres humanos actualmente no están siendo eficaces para combatir infecciones que hasta hace poco tiempo eran tratables, debido a la resistencia que algunos microorganismos están desarrollando contra esos medicamentos. Por este motivo la Organización Mundial de la Salud (2014) ha llamado la atención sobre la necesidad de buscar nuevos tratamientos antimicrobianos, principalmente antibióticos. Los insectos sociales tienen algunas características que los hacen organismos ideales para buscar nuevos antibióticos, por ejemplo, viven en colonias de muchos individuos en condiciones relativamente estables y acumulando desechos, de forma similar a como viven los humanos en las ciudades.  A pesar de ser un grupo que presenta las mismas características de otros insectos sociales, se conoce muy poco sobre las comunidades de microorganismos asociadas a las avispas sociales Neotropicales (Epiponini). Por este motivo el objetivo de este proyecto es estudiar los microorganismos productores de antibióticos asociados a las colonias de avispas sociales, para evaluar su acción antibiótica. Se integrarán los resultados obtenidos para hacer una interpretación evolutiva sobre la relación entre los microorganismos y las diferentes especies de avispas. Los resultados obtenidos serán muy importantes en el estudio de nuevas sustancias antibióticas y también ayudarán a entender el establecimiento de las relaciones simbióticas entre microorganismos y avispas.

PALABRAS CLAVE: Microorganismos, avispas sociales, actividad antibiótica, nidos.

Optimización del protocolo de establecimiento de cultivos celulares de Plantago Major (llantén) para la comprobación de la actividad cicatrizante de un producto farmacéutico y determinación efecto biológico contra la infección de h. Pylori en modelos in vitro.    

Especies del género Plantago entre ellas Plantago major han sido relacionadas con propiedades medicinales muy importantes con base  en la diversidad de compuestos presentes en sus células. Compuestos aislados de P. major pueden ayudar a la regeneración de heridas; por ejemplo, el plantamajosido y acteosido tienen actividades antibacterianas; algunos flavonoides y los derivados del ácido cafeico presentan capacidad antioxidante, erradicando los radicales libres; algunos polisacáridos pécticos se han descrito como eficaces contra las úlceras en ratas y por tener actividades inmunomoduladoras; por último, la cadena larga de alcoholes primarios saturados, que están presentes en la cera de la hoja, estimula el proceso de curación de heridas superficiales.

Costa Rica ocupa el noveno lugar en la incidencia de cáncer gástrico per cápita, por lo que se considera de alta importancia explotar la actividad citoprotectora de la mucosa gástrica atribuida a diferentes compuestos presentes in P.major como flavonoides, terpenoides y alcaloides, los cuales tienen un efecto antiácido y antiinflamatorio sobre la misma y pueden estar participando de forma positiva en la prevención de la infección por Helicobacter pylori. El interés del proyecto  se avoca  principalmente a   la prevención del cáncer gástrico, mediante el combate de la bacteria

H. pylori, presente en el estómago de los afectados. Por otro lado se pretende la comprobación de la actividad de proliferación y migración celular de las células de la dermis en un medio de crema elaborada bajo especificaciones comerciales estandarizadas a partir de los extractos de

P. major obtenidos de los cultivos celulares.

PALABRAS CLAVE: Plantago major, callos, cultivos celulares, Helicobacter pylori, actividad cicatrizante, antimicrobiana

Cada año en nuestro país se detectan cerca de 1000 nuevos casos de cáncer de mama, causando el 14% de las muertes femeninas al año. Según datos reportados por la CCSS, con respecto a la mortalidad ocasionada por cuadros de cáncer de mama, se ha visto un aumento del 5% desde el 2000 al 2012, afectando principalmente a mujeres, de entre 15 y 74 años de edad; por lo anterior y muchas otras razones, actualmente se busca crear alternativas para su tratamiento y prevención. Dentro de esta línea, el cultivo in vitro de plantas medicinales como P. niruri y P. acuminatus, mediante técnicas innovadoras como la inducción de raíces pilosas, no sólo garantiza material de alta calidad y con mejores rendimientos de agentes bioactivos, sino que debido a
esto, se puede aprovechar el potencial de las propiedades anti cancerígenas de dichos compuestos. El género Phyllanthus en general se caracteriza por sus propiedades antioxidantes, potencial de prevención del cáncer y actividad antitumoral, relacionadas con la presencia de compuestos como alcaloides, flavonoides, lignanos, fenoles, taninos y terpenoides que posee el género. Entonces, sobre la base de que la técnica de hairy roots busca una mayor producción de raíces adventicias con el fin de aumentar la producción de metabolitos secundarios, este proyecto tiene por objetivo obtener raíces de cabellera de Phyllanthus acuminatus y P. niruri por agroinfección con Agrobacterium rhizogenes para la obtención de compuestos bioactivos con actividad sobre líneas celulares de cáncer de mama.

Palabras clave: Agroinfección, citotoxicidad, compuesto bioactivo, inmunocitoquímica, línea celular

Después de la sangre, el hueso constituye el tejido más utilizado en cirugía reconstructiva del aparato musculoesquelético, su obtención y uso en injertos tisulares como opción terapéutica ha ido en aumento en los últimos años, ya que induce una mejora significativa en los procesos de sanación y recuperación de los pacientes sometidos a estos procedimientos. La obtención y almacenamiento de tejido cadavérico para trasplante permitiría que por cada donante se extraiga la mayor cantidad de piezas distintas que pueden ser utilizadas en diferentes procedimientos. No obstante, para implementar dicha alternativa se hace necesario el establecimiento de los protocolos para la extracción, procesamiento y esterilización de las piezas extraídas. Existen normas y recomendaciones internacionales para la implementación de estos procedimientos a nivel local, sin embargo, se enfatiza la necesidad de realizar procesos de estandarización y validación para asegurar la calidad de los procedimientos, lo cual hasta el momento no se ha realizado en nuestro país. Dentro de los métodos más utilizados de esterilización de hueso se encuentra la irradiación gamma, para la cual se debe procurar que la radiación penetre totalmente el tejido. La dosis considerada estándar de oro son 25kGy, sin embargo, algunos estudios, mencionan que es insuficiente, por lo que aplican dosis más altas, con lo que se corre el riesgo de alterar factores importantes como la estabilidad del colágeno, la estructura, resistencia biomecánica y capacidad ostoinductiva del hueso, mientras que, el uso de dosis más bajas compromete la esterilidad del tejido, elevando el riesgo de contaminación y trasmisión de enfermedades. A pesar de existir estándares internacionales para varios de los procedimientos que se pretender implementar, la recomendación general es validarlos a nivel local. Esta investigación pretende establecer y validar los procedimientos para la ablación de hueso y su procesamiento para uso clínico, fomentando a la vez el uso del equipo de irradiación gamma en el área de salud y procurando el traslado de los resultados al sector salud. Existe una alta demanda de material biológico en los diferentes centros de salud del país, como lo reflejan la prensa nacional, estadísticas de la CCSS y del Hospital del Trauma, por lo que la mayor justificación para realizar esta investigación es la capacidad actual que tiene el ITCR de contribuir a disminuir esta demanda y con ello mejorar la calidad de vida de los habitantes y continuar contribuyendo al desarrollo de nuevas estrategias tecnológicas que aporten a la salud humana. 

PALABRAS CLAVE: Hueso, Irradiación gamma, Sistema Musculoesquelético, Banco de Tejidos, Medicina Regenerativa.

El establecimiento y funcionamiento del Laboratorio de Ingeniería de Tejidos (LAINTEC) en el Centro de Investigación en Biotecnología del ITCR, implica que esta institución cuenta en la actualidad con la infraestructura, el equipo especializado y el personal capacitado para el desarrollo de nuevos proyectos de investigación y de tecnologías novedosas, relacionadas con las áreas de Biomedicina, Biología Celular y Molecular y Biotecnología, donde particularmente se ofrece la ventaja de estudiar y aplicar estrategias novedosas en
modelos celulares de origen animal. En la actualidad, diversos grupos en el ITCR estudian especies vegetales de interés científico y agrícola, muchas de las cuales se ha reportado que cuentan con propiedades medicinales o de valor agregado para la dieta, tales como actividad antioxidante o anticancerígena. El Laboratorio de Ingeniería de Tejidos ofrece la posibilidad de implementar la ejecución de bioensayos en modelos celulares de origen animal, incluyendo células humanas.

En este sentido, la presente propuesta plantea la oportunidad de establecer en el ITCR los protocolos para el análisis en modelos in vitro de la actividad biológica de sustancias de origen vegetal utilizando como modelo de estudio preparaciones acuosas de tres especies de interés científico nativas de Costa Rica (Rubus adenotrichus, Phyllanthus acuminata y Jatropha curcas), por lo cual se podrá caracterizar parte de la actividad biológica in vitro de estas especies, y a la vez permitirá al ITCR proveer de técnicas avanzadas de evaluación molecular en el mediano plazo como un servicio a la comunidad (productores, empresarios, investigadores, docentes y estudiantes de grado y posgrado) en Costa Rica.

Palabras claves: Citotoxicidad, viabilidad celular, proliferación celular, apoptosis, estrés oxidativo, líneas celulares, Rubus adenotrichus, Phyllanthus acuminata, Jatropha curcas.

Desarrollar un estudio químico bioguiado de extractos de octocorales pertenecientes a la diversidad marina del Pacífico de Costa Rica, para el descubrimiento de nuevos metabolitos con potencial actividad anticancerígena.